「歩兵第六十五連隊戦友名簿」（歩六五残桜会編集・１９８４年７月発行）によると、１９０７（明治４０）年１２月、仙台で編成、翌１９０８年６月、会津若松に移った。しかし、１９２５年１月、軍縮で解隊。１９３７年９月１６日に軍旗を再拝授、同月１８日に将校１０９人、下士官・兵３５８６人で再編成された。
この時から南京侵攻時まで、連隊長が両角（もろずみ）業作大佐であったことから通称「両角部隊」と呼ばれた。ほとんどが福島県出身者で占められ、会津若松で編成されたため、「会津の六十五連隊」「白虎部隊」などの通称もある。
南京侵略時の組織は、上海派遣軍（司令官・朝香宮鳩彦王中将）と第十軍（柳川平助中将）などで構成する中支那方面軍（司令官・松井石根大将）で、南京周辺に展開した。歩兵第六十五連隊は上海派遣軍の下の第十三師団に所属していた。
同年１０月には上海戦で計６２０人が戦死。１１月の江陰城攻略戦では８０人、南京攻略戦で７人の戦死者を出した。翌１９３８年９〜１０月の大別山突破作戦では２２６人、１９３９年１２月の冬期作戦では３０３人が戦死するなど、大勢の死者を出した。
このため、５３回にわたって兵の補充が行われた。戦争が長引くにつれ、多くの部隊が南方に回されたが、六十五連隊は、兵は順番に日本に戻りながらも、敗戦まで中国にくぎ付けにされた。
１９４５年８月１５日の終戦は衝陽で迎えた。２６日には軍旗を焼き、同年１０月３日に武装解除。同５日から約８カ月間、江西省湖口地区で抑留生活。長崎県の佐世保港などに復員したのは１９４６年６月だった。